一、项目来源与背景

　　我国养殖大黄鱼 ( Pseudosciaena crocer )主要在福建省内，随着大黄鱼养殖规模的扩大、以及环境因素等影响，海水网箱养殖的大黄鱼病害频繁发生，每年因疾病引起的损失占养殖产量的20%~30%，有些区域损失率甚至高达90%。因此，病害成为阻碍大黄鱼健康养殖的重要方面，也是大黄鱼人工养殖过程中亟待解决的问题。当前确定的养殖大黄鱼的病害主要有病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫疾病，其中以细菌性疾病危害较大，损失最严重。而溃疡病是较为常见、发病率范围广且危害严重的细菌性疾病之一。它可由副溶血弧菌、哈维弧菌及溶藻弧菌等多种致病弧菌引起，并且这些致病弧菌均是条件致病菌，其发病率和死亡率高给大黄鱼养殖业带来了严重的经济损失。如何快速地检测出大黄鱼是否感染此类细菌，能够为病害防治提供重要参考。

　　二、技术原理及性能指标

　　环介导恒温扩增技术 (Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是一种基因恒温扩增新技术。因 Bst DNA 聚合酶具有链置换活性，LAMP 检测技术依赖于此酶，通过 4 条特异性引物识别靶基因上的特定区域（6 个），通过链置换反应和 2个环介导，在等温条件下实现快速扩增基因。

　　三、技术的创造性与先进性

　　基于链置换DNA聚合酶作用下的环介导等温核酸扩增技术，建立了三种大黄鱼病原溶藻弧菌、哈维弧菌和副溶血弧菌Lamp快速检测方法。该方法解决了传统PCR方法、实时荧光定量PCR需精密昂贵仪器、对检验操作人员和实验环境要求高等问题，产物后续无须进行电泳，简化了操作步骤。三种病原的Lamp快速检测方法特异性好，稳定性高，最低检测限均低于10fg/μL，检测在60 min内完成。对实际样品的检测实验中，Lamp方法与PCR方法的结果一致，但与之相比，极大缩短了反应时间，适合于快速的现场检测。

　　四、技术的成熟程度、适用范围和安全性

　　1、致病菌中间特异种内保守基因片段的筛选与LAMP的引物设计：利用在线设计软件设计LAMP引物，通过实际扩增结果进行筛选。2、LMAP反映体系的优化与LAMP技术特异性、灵敏度与可视化的研究：对影响LAMP反应的条件进行优化实验，根据实验结果进行LAMP扩增；在最优LAMP条件下，以多种其它致病菌模板DNA为检测对象，评价LAMP引物特异性；通过对致病菌DNA模板的梯度稀释，评价LAMP检测的灵敏度；通过可视化方法进行观察。3、LAMP方法与传统方法的比较验证研究至养殖场取病鱼，通过与普通PCR检测结果的比较，验证LAMP技术的特异性和灵敏性。4、将上述建立的LAPM技术用于基层实践。本研究利用上诉技术建立了三种弧菌以及弧菌属的LAMP检测方法，与传统方法相比具有省时省力、操作简单、费用节省、特异性强、灵敏度高等特点，并且不需要昂贵的设备，仅需要一台水浴锅即可完成检测。该方法的建立可望为基层养殖场中开展水产动物致病菌的适时确诊和防控提供有效手段，具有广阔的应用前景。该项目的推广与应用不仅可以节约大量资金成本，还可以产生可持续发展的巨大社会经济效益。